親和柱的制備實驗_配基固相化技術

溴化氰活化的瓊脂糖凝膠用于配體固相化是實驗室最常用的固相化技術之一。其原理是溴化氰活化的介質與配體主要的氮基反應形成異脲鍵。但是這樣偶聯的親和柱多次重復使用時，將會有少量配體脫落，所以反復使用的親和柱應考慮選擇其他活化的介質。異脲鍵的形成伴有荷電基團的增加，將會影響離子交換作用。為了克服這一影響要在純化時采用至少 0.1 mol／L 的緩沖鹽液。該固相化方法簡便廉價，并可廣泛用于蛋白質、核酸和凝素。

溴化氰活化的瓊脂糖凝膠

鹽酸偶聯緩沖液阻斷緩沖液

玻璃漏斗玻璃棒真空泵

1. 取 2 g 溴化氰活化的瓊脂糖凝膠加入玻璃漏斗內 1 mmol/L 鹽酸中，用玻棒輕輕攪動 20 min直至介質完全溶脹。靜置待混懸的介質沉降后，用真空泵吸去液體。1 g 干凝膠可以獲得 3.5 ml 溶脹膠；

2. 用 200 ml 1 mmol/L 鹽酸洗介質，共3次，每次洗后吸去液體；

3. 用偶聯緩沖液（0.1 mol/L 碳酸氫鈉，0.5 mol/L 氯化鈉，pH 8.3）冼介質一次。因為活化基團在偶聯緩沖液 pH 值下易水解，所以此步驟應盡可能快的進行，最好在幾分鐘內完成；

4. 轉移活化的瓊脂糖凝膠至含 60～400 nmol 配體的 30 ml 偶聯緩沖液的燒瓶里。如需測定結合效率一定要取少量配體溶液待測；

5. 室溫下輕輕混合、搖動或振動 2 h，或 4℃ 過夜。不宜用磁力攪拌器處理，它能攪碎瓊脂糖凝膠顆粒。如需測定結合效率此步驟結束時取少量溶液待測；

6. 在燒結玻璃漏斗中用 200 ml 偶聯緩沖液洗偶聯介質一次；

7. 轉移偶聯介質至含 100 ml 阻斷緩沖液（1 mol/L 乙醇胺， 鹽酸調 pH 至 8.0） 的燒瓶內。室溫孵育 2 h 或 4℃ 過夜；

8. 在燒結玻璃漏斗中依次用 100 ml 偶聯緩沖液 100 ml 乙酸鹽緩沖液（0.1 mol/L 乙酸鈉，0.5 mol/L 氯化鈉，pH 4.0） 洗偶聯介質各一次；

9. 重復四次步驟 8；

10. 如偶聯介質不準備立即使用，應用含 0.02％ 疊氮鈉的偶聯緩沖液再洗一次；

11. 配體固相化已完成，偶聯好的介質可以裝柱。

1. 估算結合效率。通過檢測偶聯前后所取的待測溶液中配體濃度，可以知道被固相化配體的置，從而計算出結合效率一般來講，70％～80％ 的結合是最佳的；低結合將導致親和柱的結合容量下降；過高的結合會產生空間障礙造成親和柱結合能力減少。

2. 許多因素都會影響偶聯，造成很低的偶聯效率。常見的主要有：過低的配體濃度、不適宜的 pH、配體不純、介質處理不當、不適宜的偶聯緩沖液及配體不易接近等。其中配體不易接近常由于存在空間障礙或配體過大造成。加入適量非離子去垢劑或促溶劑也許能獲得改善。此外，類似 Tris 這樣含有氨基的成分配制的緩沖液不宜使用，因為它們可能與介質偶聯。

3. 若配體在堿性 pH 下不穩定，偶聯也可在較低 pH 的緩沖液內進行，但是效率會降低。