• <table id="caaaa"><source id="caaaa"></source></table>
  • <td id="caaaa"><rt id="caaaa"></rt></td>
  • <table id="caaaa"></table><noscript id="caaaa"><kbd id="caaaa"></kbd></noscript>
    <td id="caaaa"><option id="caaaa"></option></td>
  • <noscript id="caaaa"></noscript>
  • <td id="caaaa"><option id="caaaa"></option></td>
    <td id="caaaa"></td>
  • 發布時間:2020-08-17 15:31 原文鏈接: 親和層析實驗:常規方法(三)

    6.仿生配基

    大部分的親和層析配基是天然存在的,其優點在于具有高度選擇性和強結合能力,但也存在某些缺點。這種配基穩定性低,需要進行純化,使用過程中批間差異大,易被其他生物分子污染,對滅菌方法敏感,并且成本高。為了克服這些局限性,加速親和層析在治療性蛋白質純化中的應用, 仿生型配基 (biomimetics)—合成親和配基或變構的親和配基已經成為研發重點,這是一種模仿天然生物配基結合方式和結構的物質。

    活性紡織染料適用性強,呈現出多種競爭性生物分子具有的表面極性和空間構向性特征,可在水溶液中作為很多蛋白質的競爭性抑制劑、輔酶或效應分子,是應用最廣泛的仿生配基之一 (MadoeryandMinchiotti,2006;Stellwagen,1”0)。包括應用最廣泛的 CibacronBlueF3 G 染料在內,大多數仿生配基都含三嗉支架(triazinescaffold), 將其修飾后可以提高特異性,這也是仿生染料-配基概念的基礎。在過去的幾十年里,開發了充足的應用于蛋白質的廣譜的,也即非特異性的純化染料,包括針對血液蛋白(白蛋白)、還原酶、脫竣酶、糖酵解酶、核酸酶、水解酶、裂解酶、合成酶和轉移酶等,并且將染料作為配基的親和層析材料已經商品化 (表 26.2)(1^^0 11 抓~1 00 1^,1994;2002)。除了拓展商品化材料外,特制的仿生材料日顯優越并逐漸普及。通過模擬靶蛋白中的肽段、天然生物識別基序或暴露表面的互補殘基, 進而設計針對特異性靶蛋白的配基,這可通過設計合理的組合文庫再經合成、篩選進行制備 (Ceciliaetal.,2005;Labrou,2003;Loweetal.,2001)。通過親核取代反應在堿性條件下用載體表面的輕基取代染料中的氯,可以將含三嗪的染料固定在親和介質 (如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素)上(Labrou,2000;LabrouandClonis,1994;Labrouetal.,1995)。

    7.共價親和層析

    通常親和層析是以靶分子與配基之間的可逆的相互作用為基礎,但也可以通過共價相互作用分離特殊的 IE 分子(BlumbergandStrominger,1972;GEHealthcare,2007;Hage,2006) o 靶分子中的巰基與純化介質上固定的活化巰基之間就是一種共價連接作用。可通過用 2-巰基乙醇、TCEP(乙基) 或二硫蘇糖醇還原半胱氨酸的二硫鍵,洗脫結合的蛋白質。

    最近研發了另一種以共價結合為基礎的純化,即特異性的氯化烷烴配基(chloroalkane) 和 HaloTag 蛋白之間的共價相互作用,如圖 26.1 所示 (Losetal.,2008;Ohanaetal.,2009)。HaloTag 是一個 34kDa 單體蛋白融合標簽,可以根據需要通過基因技術與蛋白質 C 端或 N 端融合。HaloTag 蛋白由細菌鹵代掠經脫鹵素酶 (haloalkanedehydroIase) 演變而來,首先對其活性位點進行修飾,以形成具有特異氯化烷烴配基的永久共價鍵。接著再通過突變增加蛋白質的穩定性, 并達到類似于生物素-鏈霉素的結合速率。在此基礎上開發了一種基于 HaloTag 性質進行純化的層析介質,即帶有氯化烷烴配基的 HaloUnk 樹脂。該層析介質對 HaloTag 融合蛋白的共價捕獲結合速率快,克服了傳統親和純化中平衡相關的局限性,能夠實現對極低豐度靶蛋白的高效捕獲。此外,這種層析介質可以接受多種嚴格的洗脫條件,不會損失結合的蛋白質。雖然共價聯合有其優勢,但在洗脫目標蛋白質方面也面臨著挑戰。由于 HaloTag 和氯化配基之間的共價鍵不可逆,因此不能利用傳統方法從樹脂上洗脫蛋白質。但是,目標蛋白質可以由特定的蛋白酶 (TEV) 釋放, 其識別位點位于兩個基團(HaloTag 和融合靶蛋白)之間。一旦被酶切,HaloTag 融合的蛋白質就會被釋放,而 HaloTag 仍保持結合在樹脂上,形成髙純度的無標簽蛋白(Urhetal.,2008)。

    根據 HaloTag 自身的特性,除了前面描述的利用 HaloTag 純化融合蛋白以外,還可以將 HaloTag 融合物固定作為親和配基。類似于 ProteinG,可以用于純化能與 Halo-Tag 融合蛋白特異性結合的抗體或其他蛋白質。該系統的優點在于,與其他共價固定技術不同,HaloTag 的固定化是通過活性位點進行單點吸附,因此可以定向。其他共價固定技術中蛋白質的結合是隨機的,可能會導致多個吸附位點和定位不正確。單點定向吸附能力可增加系統的有效性和再生能力,HaloTag 融合物與介質共價結合, 可以改進特異性抗體純化方法或 HaloTag 結合蛋白的分離方法。

    三、化學吸附作用

    一些傳統介質,如脂糖、纖維素、二氧化硅、玻璃及合成的高分子支持物,其表面與親和配基形成共價化學吸附,本節將簡要回顧其中較常見的吸附形式。從策略上分析,化學吸附作用可以分為 3 個部分:①介質表面或樹脂 (介質);②連接組分或樹脂活性的成分 (間隔);③親和配基。配基活性基團的類型和可用性限定了其如何與介質表面吸附。常見的基團是伯胺基、巰基和羧基。也可將配基修飾構建活性基團,如碳水化合物的氧化或正交活性基團的共價吸附,為配基的固定方式提供更多的選擇。合成小分子的吸附策略趨于遵循與生物大分子相同的化學途徑,但是在設計時往往也會有不同的考慮。

    1.表面活化

    制備共價親和介質表面首先從表面活化開始。介質表面以兩種方式接受配基,直接接受或通過活化連接物而接受配基,后者目的在于物理「隔離」配基與介質表面。表 26.3 總結了典型化學吸附,其中列出了已經構建的介質表面,并與用于吸附活化表面的配基主體進行對照。已經有多種已經商品化的預活化介質表面,所涉及的化學吸附類型多數可見表 26.3。如果配基表面已有合適的化學基團,那么其他要考慮的就可簡化為明確最優的反應環境,這要權衡偶聯反應發生的條件和影響配基穩定性的條件。大多數配基的偶聯反應在水溶液中進行, 控制緩沖液的 pH,反應時間為 1~20 h, 反應溫度介于 4°C 和室溫之間。由于反應的異質性,濃度和混勻程度對確保反應物均一分布是非常重要的。盡可能保持反應的液相體積不超過樹脂的 2 倍。配基濃度會因分子類型不同而變化, 但是對于蛋白質, 以 2.5~10 mg/mL 作為起始濃度是合適的。偶聯反應可有較寬的 pH 和緩沖范圍, 這取決于活化化學作用和配基活性(Hermanson,1992)。不同系統的表面活化效率各異,因此,封閉多余的表面反應基團以中和或降低非特異性反應是必要的。


    人体艺术视频