乙型肝炎病毒大蛋白檢測在拉米夫定抗病毒治療中的應用研究
目的
通過檢測拉米夫定治療患者血清中的乙型肝炎病毒大蛋白（HBV-LP），同時檢測乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）載量，探討拉米夫定治療過程中HBV-LP與HBV-DNA的關系，觀察乙型肝炎病毒大蛋白用于評估拉米夫定抗病毒治療效果的應用效果。方法 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的方法對HBV-LP進行檢測；采用熒光定量PCR方法對HBV-DNA進行檢測。
結果
抗病毒治療有效的患者HBV-DNA和HBV-LP下降趨勢一致，HBV-LP出現陰轉的時間要晚3個月于HBV-DNA陰轉；抗病毒治療無效的患者HBV-DNA和HBV-LP都是始終沒有出現陰轉；抗病毒治療效果反復組中患者HBV-LP始終沒有出現陰轉，HBV-DNA則暫時陰轉。
結論
拉米夫定抗病毒治療過程中動態檢測乙型肝炎病毒大蛋白可用于評估抗病毒治療效果。
[主題詞] 乙型肝炎病毒大蛋白；肝炎病毒, 乙型；抗病毒治療
Application of serum hepatitis B virus large surface protein determination in lamivudine anti-viral therapy for patients with hepatitis B LI Guang-yi, SHENG Jiang-lai, HUANG Hai-jun. People's Hospital of Anji County, Zhejiang Province (Li G and Sheng J), Anji, Zhejiang, 313300, China and The First Hospital Affiliated to Zhejiang University (Huang H)【Abstract】Objective To study the correlation between serum hepatitis B virus large surface protein （HBV-LP）and hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) load in hepatitis B patients treated with lamivudine, and the application of serum HBV-LP measurement in evaluation of lamivudine therapeutic effect and end point judgement. Methods HBV DNA was detected by fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR), serum HBV-LP was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Both HBV-DNA and HBV-LP decreased in patients responding to lamivudine therapy, and HBV-LP turned negative 3 months later than HBV-DNA. In patients resistant to lamivudine therapy, neither HBV-DNA nor HBV-LP turned negative. In patients whose symptoms relapsed, HBV-LP didn’t turn negative, while HBV-DNA was undetectable only transitorily. Conclusion Measuring serum HBV-LP dynamically can be useful in evaluation of lamivudine therapeutic effect.
[Key words] Hepatitis B virus; Hepatitis B virus; large surface protein; Antiviral therapy
作者單位：313300 浙江省安吉縣人民醫院（黎廣益、盛江來）；浙江大學附屬第一醫院研究生（黃海軍）
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 感染是我國常見的引起慢性肝炎的病毒感染之一，隨著人們對乙肝病毒的認識越來越深入，在預防、診斷和治療方面都有所突破，但傳統常規診斷方法（如乙肝三系和HBV-DNA檢測）已不能全面、真實、快速的反應乙肝病毒在患者體內感染狀況和抗病毒治療的效果[1.2]。近年來隨著對乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）在乙肝發病機制、感染與復制等方面研究的深入，研究人員逐漸認識到HBV-LP具有越來越重要的臨床意義。我們使用HBV-LP酶免試劑盒，動態檢測拉米夫定抗病毒治療過程中HBV-LP含量，用于評估拉米夫定抗病毒治療效果以及判定治療終點。
1 材料與方法
1.1 研究對象 31名拉米夫定抗病毒治療患者為我院和浙醫一院2005年7月至2007年11月住院或門診患者，其中男性20例，女性11例，年齡23~63歲，平均年齡39歲，抗病毒治療之前均符合2000 年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中的病毒性肝炎診斷標準。
1.2 樣本采集 在乙肝患者抗病毒治療期間設立檢測點，分別治療后是0、3、6、9、12個月，每個檢測點時被觀察對象均于清晨空腹抽取5 ml 外周靜脈血，2000G離心10 min ，分離血清并檢測HBV-LP、HBV-DNA、HBV-M等。
1.3 試劑和方法 乙型肝炎病毒大蛋白采用酶聯免疫方法檢測，試劑盒由北京熱景生物技術有限公司提供；HBV-DNA實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司；乙肝兩對半（HBV-M）酶聯免疫檢測試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司。所有試劑盒均在有效期內，均嚴格按試劑盒操作說明進行。
1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析計量資料用.x ±s 表示,計數資料用率表示。
2 結 果
2.1 抗病毒治療有效的患者HBV-DNA和HBV-LP變化趨勢比較：
以用藥12個月時HBV- DNA出現陰轉（拷貝數＜103）為抗病毒治療有效，共有18例患者在為期12個月的拉米夫定抗病毒治療過程中治療有效，表1中的數據顯示，在治療過程中HBV DNA的下降趨勢和HBV-LP下降趨勢一致，但是HBV-LP出現陰轉（吸光密度A值＜0.105）的時間要晚于HBV-DNA出現陰轉，HBV-LP陰轉的時間平均比HBV-DNA的陰轉晚3個月左右。
表1 有效組中HBV-DNA拷貝數對數值、HBV-LP A值平均值、陰轉率比較
Tab.1 Logarithm of HBV-DNA copy numbers, HBV-LP A value and negative conversion rate in patients responding to lamivudine therapy
檢測時用藥時間（月） Duration of medication | HBV-DNA拷貝數對數值No. of HBV DNA copies (log10) | HBV-LP A值A value of HBV-LP | HBV-DNA陰轉例數（%）No. of cases HBV DNA became negative (%) | HBV-LP 陰轉例數（%）No. of cases HBV-LP became negative (%) |
| 0 | 6.170 | 1.311 | 0（0） | 0（0） |
| 3 | 0.944 | 0.444 | 13（72.2） | 3（16.7） |
| 6 | 0.333 | 0.230 | 16（88.9） | 11（61.1） |
| 9 | 0.167 | 0.114 | 17（94.4） | 15（83.3） |
| 12 | 0.000 | 0.082 | 18（100） | 16（88.9） |
2.2 抗病毒治療無效的患者HBV-DNA和HBV-LP變化趨勢比較 以治療12個月中HBV- DNA沒有出現陰轉（拷貝數＜103）為抗病毒治療無效，共有10例患者，HBV-DNA和HBV-LP都是始終沒有出現陰轉，而且HBV-LP均是在較高的水平（A＞1.0）。
表2 無效組中HBVDNA拷貝數對數值和HBV-LP A值平均值比較
Tab. 2 Logarithm of HBV-DNA copy numbers and HBV-LP average A value in patients resistant to lamivudine therapy
| 檢測時用藥時間（月）Duration of medication (m) | HBV-DNA拷貝數對數值No. of HBV DNA copies (log10) | HBV-LP A值A value of HBV-LP | ||
| 0 | 7.333 | 1.460 | ||
| 3 | 5.222 | 1.254 | ||
| 6 | 4.467 | 1.192 | ||
| 9 | 4.889 | 1.183 | ||
| 12 | 5.556 | 1.191 |
2.3 抗病毒治療效果反復組中患者HBV-DNA和HBV-LP變化趨勢比較 以治療過程中出現了HBV-DNA陰轉（拷貝數＜103），但是之后HBV-DNA又出現陽轉為抗病毒治療效果反復，共有3例患者，圖3中的變化趨勢顯示，在治療過程中HBV-DNA出現了暫時陰轉，而HBV-LP但是始終沒有出現陰轉。
表3 反復組中HBV-DNA拷貝數對數值和HBV-LP A值平均值比較
Tab.3 Logarithm of HBV-DNA copy numbers and HBV-LP average A value in patients whose symptoms relapsed
| 檢測時用藥時間（月）Duration of medication (m) | HBV-DNA拷貝數對數值Log10 of the No. of HBV DNA copy number | HBV-LP A值A value ofHBV-LP | ||
| 0 | 6 | 1.042 | ||
| 3 | 3.25 | 0.594 | ||
| 6 | 0 | 0.645 | ||
| 9 | 1.5 | 0.638 | ||
| 12 | 3.25 | 0.581 |
3 討 論
慢性乙肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因，抗病毒治療是阻止肝硬化進程及肝癌發生的關鍵措施，但是抗病毒治療藥物尤其是核苷類似物尚無可靠的治療終點，以目前用的最多的核苷類似物拉米夫定（LAM）為例， LAM 治療出現HBeAg血清轉換后復發率較高[3-6]，HBeAg 血清轉換并不能用于判定治療終點。另外，拉米夫定等核苷類似物只能抑制HBV-DNA復制，不能徹底清除cccDNA[7。8]， 而共價閉合環狀DNA（cccDNA）是乙肝病毒前基因組復制的原始模板，因此血清HBV DNA雖然可以用作評估抗病毒療效的重要指標， 但HBV-DNA的陰轉也不能做為抗病毒治療的終點。
乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）與病毒的侵入、成熟和組裝密切相關，其不僅存在于Dane顆粒上，還存在于不含HBV DNA的管狀顆粒上。抗病毒治療直接抑制HBV-DNA復制，但殘留的病毒前基因組仍將合成蛋白并組裝成不含DNA的管狀病毒顆粒，因此管狀病毒顆粒仍將延續存在一段時間，直至病毒基因組衰減完。本研究對31例拉米夫定抗病毒治療患者進行動態的監測，結果顯示在治療有效組中，HBV-LP和HBV-DNA的變化趨勢一致，但是比HBV-DNA的陰轉要晚，平均陰轉時間要晚3個月。
Summers[9]發現乙型肝炎病毒大蛋白具有上調cccDNA拷貝數的功能、激活cccDNA再復制等功能；Bruns M以鴨乙型肝炎為模型，發現管狀顆粒上的乙肝病毒大蛋白反式激活并顯著增強細胞內的病毒復制和基因表達[10]。過量乙肝病毒大蛋白在肝細胞內積聚是導致內質網應激的關鍵因素[11]，血液中大蛋白殘留與病情反復密切相關。本研究中發現治療無效組中HBV-LP和HBV-DNA均始終沒有出現陰轉；在治療反復組中HBV-LP始終沒有出現陰轉，HBV- DNA則暫時陰轉后反彈。
目前臨床抗病毒治療過程中，在HBV DNA陰轉后通常會繼續用藥以防止病情反復，由于乙型肝炎病毒大蛋白晚于HBV- DNA的陰轉，并具有反式激活病毒復制能力，因此在監測病毒復制、觀察治療效果上具有重要作用。
4 參考文獻
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