1)原理
維生素D在三氯甲烷溶液中,與三氯化銻結合生成一種橙黃色化合物,顏色的深淺與維生素D的濃度成正比,在500nm波長下測定其吸光值。
2)儀器
①可見/紫外分光光度計。
②分離柱。
3)試劑
①三氯化銻(250g/L)-三氯甲烷溶液 將25g干燥的三氯化銻迅速投入裝有100mL三氯甲烷的棕色試劑瓶中,振搖,使之溶解,再加入無水硫酸鈉10g。用時吸取上層清液。
②三氯化銻三氯甲烷-乙酰氯溶液 在上述試劑①中加入為其體積3%的乙酰氯,搖勻。
③無水乙醚 不含過氧化物,檢查方法與處理方法同維生素A和維生素E測定。
④無水乙醇 不含醛類物質,檢查方法與處理方法同維生素A和維生素E測定。
⑤石油醚(沸程30～60℃):重蒸。
⑥維生素D標準溶液 稱取0.25g維生素D,用三氯甲烷稀釋至100mL,此液濃度為2.5mg/mL。臨用時以三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/mL的標準使用液。
⑦聚乙二醇(PEG)600。
⑧白色硅藻土:Celite545(柱色譜載體)。
⑨氨水。
⑩無水硫酸鈉。
?氫氧化鉀溶液(0.5mol/L)。
?中性氧化鋁 色譜用,100～200目。在550℃灰化爐中活化5.5h,降溫至300℃左右,取出裝瓶。冷卻后,每100g氧化鋁加入4mL水用力振搖,使無塊狀,瓶口封緊儲存于干燥器內,16h后使用。
4)操作方法
(1)試樣處理
皂化與提取同維生素A和維生素E的方法,如果試樣中有維生素A共存,可用以下方法進行分離純化。
①分離柱的制備 取一支內徑為2.2cm,具有活塞和砂芯板的玻璃色譜柱。第一層:加入1～2g無水硫酸鈉,鋪平整。第二層:稱取15gCelite545置于250mL碘價瓶中,加入80mL石油醚,振搖2min,再加入10mL聚乙二醇(PEG)600,劇烈振搖10min,使其黏合均勻、然后傾入色譜柱內。第三層:加5g中性氧化鋁。第四層:加入2～4g無水破酸鈉輕輕轉動色柱、使第二層的高度保持在12cm左右。
②純化 先用30～50mL石油醚淋洗分離柱,然后將試樣提取液倒入柱內,再用石油繼繼續淋洗。棄去最初收集的10mL濾液,再用200mL.容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持2～3mL/min。將淋洗液移入500mL分液漏斗中,每次加100～150mL水,洗滌3次去除殘留的聚乙二醇600,以免與三氫化錦作用形成渾濁物,影響比色),將上述石油醚層通過無水硫酸鈉脫水后,置于濃縮器中減壓濃縮至干或在水浴上用水泵減壓抽干,立即加入5mL三氯甲烷溶解備用。
(2)測定
①標準曲線的繪制 準確吸取維生素D標準使用液(濃度視試樣中維生素D含量高低而定)0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶內,用三氯甲烷定容。取上述標準比色液各1mL于1cm比色皿中,立即加入三氯化銻-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL,在500mm波長下,于2min內測定吸光度。繪制標準曲線。
②試樣測定 吸取試樣純化液1mL于比色皿中,以下操作同標準曲線的繪制。
5)計算
式中 x——試樣中維生素D的含量,mg/100g;
ρ——標準曲線上查得試樣溶液中維生素D含量,μg/mL,如按國際單位,每國際單位=0.025μg維生素D;
V——試樣提取后用三氯甲烷定容的體積,mL;
m——試樣質量,g。
6)說明及注意事項
①本方法是AOAC選定的正式方法。本方法不能區分維生素D2和維生素D3測定值是兩者的總量。
②食品中維生素D的含量一般很低,而維生素A、維生素E、膽固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超過維生素D,嚴重干擾維生素D的測定,因此,測定前必須經柱色譜除去這些干擾成分。
③操作時加入乙酰氯可以消除溫度的影響,可使靈敏度比僅用三氯化銻提高約3倍,并可減少部分醇的干擾。