三代基因測序技術以及基因檢測技術的發展綜述

基因是指攜帶有遺傳信息的DNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位，一段具有功能性的DNA序列。基因通過指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現。人類約有兩萬至兩萬五千個基因。廣義上的基因檢測指通過血液、組織或細胞分泌物，對染色體、DNA分子進行檢測的一系列技術。目前在醫療領域，基因檢測除直接人體DNA分子外，還可通過檢測人體內微生物基因信息，判斷受檢者健康狀況和疾病風險。

一般情況下，基因通過復制把遺傳信息忠實地傳給下一代，使其呈現出與親體相似的性狀如身高、血型等。有些基因與人體健康狀況密切相關，其不一定直接導致某種疾病發生，也可能通過影響個體，如對某些病毒、細菌的免疫力，間接“參與”疾病發生過程。如果某些基因在復制過程中出現錯誤，或受后天環境影響發生突變也可能增加個體患病幾率。而了解這些基因信息，有助于人類更好地應對疾病和健康風險。

基因檢測技術分類

目前應用較廣的基因檢測技術大致分三類：基因測序、以核酸擴增為基礎的PCR技術，以熒光雜交檢測為基礎的FISH技術。這三類技術溝通構成了基因檢測基礎，大部分基因檢測項目都有賴于這三項基礎技術開展。此外，基因芯片技術應用范圍也較廣。

PCR技術（聚合酶鏈式反應技術），可放大、擴增特定DNA片段，通常用于人體基因少量突變位點檢測、細菌或病毒基因檢測，并在二代基因測序過程中扮演重要角色。該技術優點是靈敏度高、操作相對簡便，但中間樣本制備過程可能存在交叉污染。

FISH技術（熒光原位雜交技術），可利用已知的DNA變異序列，與被檢測的樣本DNA序列雜交、互補配對，從而發現樣本DNA的異常情況。基因芯片技術則是將大量已知DNA序列做成探針，集成在同一芯片上與標記樣品分子進行雜交，從而獲得樣本序列信息。該技術優點是成本相對較低、效率較高，但難以發現未知區域信息。

基因芯片又稱DNA微陣列(DNA micro-array), 是把大量已知序列探針集成在同一個基片(如玻片、膜)上, 經過標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交, 通過檢測雜交信號, 對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析。

基因測序技術，采用生物化學和光學技術結合，將DNA序列中ATCG四種堿基逐一轉化為電化學信號，通過光學檢測設備識讀，報告圖為四種顏色的峰谷圖，根據信號強弱來識別四種堿基。測序技術的優勢在于，可以逐一讀出全部基因序列，雙向測序是基因檢測結果金標準，可以用于檢測未知基因；缺點是測序對樣本DNA濃度和純度要求比較高，實驗操作技術要求比較高，且每次實驗只能檢測一個位點或一段序列。

與PCR和FISH技術相比，基因測序技術可直接讀取DNA分子的30億個堿基序列，具有高通量、數據量大的特點。其中二代基因測序是當下基因檢測最熱門的技術。基因測序技術的缺點是操作復雜、對樣本DNA濃度和純度要求較高，且數據龐雜。

表1. 基因檢測技術對比

基因測序三代技術

基因測序從1977年的第一代Sanger測序技術發展至今，已經有40年的發展歷程。1987年，Applied Biosciences公司基于Sanger測序原理發布第一臺自動測序儀，第一代測序讀長長，準確率高，后來成為人類基因組計劃的主力機型，而現在也依然是測序的金標準。盡管第一代測序在準確度的優勢明顯，但是存在成本高、通量低等缺點，制約其大規模商業應用。經過技術發展和流程優化，以羅氏454、illumina、Life的Solid系統為主的第二代測序技術出現，促使測序成本以超摩爾定律下降，并且大幅提高測序速度，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅需要1周。但是缺點就是讀長太短，后續需要通過生物信息學軟件進行數據組裝。2008-2010年密集出現的第三代測序技術可謂驚艷全球。第三代測序技術是單分子測序，由于不需要對樣本進行擴增等前期準備工作，測序時間大幅縮小，理論準確性將提高，成本進一步下降，相比于第二代測序技術優勢明顯，但是目前由于準確性低、測序信號易丟失等因素，尚且處于科研階段。第四代測序技術更加先進，但也存在第三代技術的問題，短期內無法商用。

基因測序技術成本以摩爾定律方式下降

第一代基因測序法即Sanger法，采用的是直接測序法，是1975年由桑格(Sanger)和考爾森(Coulson)提出的經典的鏈終止法。其基本原理即雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每當DNA鏈加入分子ddNTP，延伸便終止。每一次DNA測序是由4個獨立的反應組成，將模板、引物和4種含有不同的放射性同位素標記的核苷酸的ddNTP分別與DNA聚合酶混合形成長短不一的片段，大量起始點相同、終止點不同的DNA片段存在于反應體系中，具有單個堿基差別的DNA序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來，得到放射性同位素自顯影條帶，依據電泳條帶讀取DNA雙鏈的堿基序列。第一代基因測序技術代表為ABI公司3700系列熒光標記自動核酸分析儀，Sanger測序法是測序技術的金標準，其測序長度可達1000bp，準確性幾乎100%，但存在通量低、成本高、耗時長的不足，嚴重影響其大規模應用。人類基因組計劃主要是基于第一代基因測序技術平臺。

圖1. 第一代測序法原理

第二代測序技術（也稱下一代測序NGS，大規模平行測序Massively Parallel Sequencing，高通量測序High-throughput sequencing），是2005年以來發展的新一代測序技術。核心原理是邊合成邊測序，其基本步驟包括文庫制備、單克隆DNA簇的產生和測序反應，可以同時并行分析陣列上的DNA樣本。與第一代測序技術相比，第二代測序技術具有高通量、低讀長、敏感性高、成本低的特點。代表性測序平臺主要包括Roche公司的454測序平臺、Illumina公司的Solexa測序平臺、ABI公司的Solid系統、Life Technologies公司的Ion Torrent個人化操作基因組測序儀。第二代測序技術在大幅提高了測序速度的同時，還大大地降低了測序成本，并且保持了較高準確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅需要1周，但其序列讀長方面比起第一代測序技術則要短很多，大多只有100bp-150bp，這就意味著需要更嚴格復雜的序列拼接技術，不僅可能產生誤差，也花費了部分時間。目前第二代測序技術是主流，約占測序設備的80%以上。

圖2. 第二代測序法原理

第三代測序技術以納米孔單分子測序技術為代表，最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。基本原理是：DNA聚合酶和模板結合，4色熒色標記4種堿基（即dNTP），在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發出不同光，根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。該技術簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，且不受鳥嘌呤和胞嘧啶或腺嘌呤和胸腺嘧啶含量的影響，具有速度快和長讀長等優點，但通量較低，測序準確率較差，目前尚不成熟。第三代測序平臺包括美國Helicos公司的HeliScope遺傳分析系統和Pacific的PacBio RS單分子實時測序系統。

表2.基因測序三代技術及儀器平臺對比

前述三種基因檢測技術，包括基因測序技術、PCR技術、FISH技術等，最早都集中出現在上世紀七、八十年代。其中，PCR技術因操作相對簡單、成本更低，率先得到大規模應用。而基因測序技術直到二代測序（NGS）的出現，才加速了其商業化進程。但基因檢測行業真正進入快速發展階段，實際上有賴于基因測序技術的發展。基因測序技術讓人類第一次，能夠獲得個體全基因組幾乎所有信息，這是人類能夠破譯基因密碼，認識疾病和基因關系的前提條件。基因測序技術發展至今，經歷了三次演變，每一代測序技術都各有優、劣勢，彼此之間互為補充，而不是相互替代。二測序技術是現在應用最廣的技術，三代測序技術目前用于科學研究中。