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高糖腹透液對腹膜間皮細胞分泌VEGF 的影響及氟伐他汀的干預作用

武 俠，劉 佳*，劉艷春，徐亞光，趙秀芬，錢 軍，邢昌贏
（南京醫科大學附屬醫院腎內科，江蘇 南京 210029）

［摘 要］ 目的：觀察氟伐他汀（fluvastatin，Flu）對高糖腹透液（high-glucose peritoneal dialysate，HGPDS）誘導的人腹膜間皮細胞
（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。 方法：體外培養 HPMCs，同步化 48 h 后，分組如下：正常對照組、HGPDS 組、HGPDS＋Flu 組、單純 Flu 組。 倒置顯微鏡觀察各組細胞形態， RT-PCR 法檢測各組 VEGF 的 mRNA 表達，Western blot 檢測各組 VEGF 蛋白的表達。 結果：與正常對照組相比，在 HGPDS 作用下，48 h 后細胞由鋪路石樣轉變為長梭形，1 × 10－6 mol ／ L Flu 可部分逆轉 HPMCs 的形態改變。 與正常對照組相比， 在 HGPDS作用下，人腹膜間皮細胞 VEGF mRNA 及蛋白表達明顯增多（P ＜ 0．05），并呈時間依賴性，VEGF mRNA 和蛋白分別在 HGPDS干預后 12 h 和 48 h 達高峰（P ＜ 0．05）。 Flu 可明顯抑制 HGPDS 誘導的 VEGF 的表達（P ＜ 0．05），并呈濃度依賴性。 結論：適當濃度的 Flu 可以抑制 HGPDS 刺激體外培養人腹膜間皮細胞 VEGF 表達增加。
［關鍵詞］ 氟伐他汀；高糖腹透液；人腹膜間皮細胞；血管內皮生長因子
［中圖分類號］ R392．12 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1007-4368（2013）06-754-05
doi：10．7655 ／ NYDXBNS20130608


The effect of high-glucose peritoneal dialysate ａnd fluvastatin on the expression of vascular endothelial growth factor in human peritoneal mesothelial cells
Wu Xia，Liu Jia*，Liu Yanchun，Xu Yaguang，Zhao Xiufen，Qian Jun，Xing Changying
（Departmentof Nephrology，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing 210029，China）

［Abstract］ Objective：To explore the effect of high-glucose peritoneal dialysate （HGPDS） ａnd fluvastatin （Flu） on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in human peritoneal mesothelial cells （HPMCs）． Methods：After incubated in DMEM with 0．01％ FBS for 48 h， HPMCs were randomly divided as follows：control group， HGPDS group， HGPDS＋Flu group， Flu alone group． The phenotype changes of HPMCs were observed by light microscopy． The mRNA expression of VEGF was observed by RT- PCR． HPMCs were treated for 48 h ａnd the levels of VEGF protein were measured by Western blot． Results：Compared with the normal control group， after incubation with HGPDS for 48 h， the cell morphology was changed from a typical cobblestone-like appearance to fibroblast-like appearance． Flu （1 × 10－6） mol ／ L could partially improved the cell morphology changed by HGPDS． The mRNA ａnd protein expressions of VEGF increased time dependently in HPMCs treated with HGPDS （P ＜ 0．05）， which peaked at 12 h ａnd 48 h， respectively． Flu significantly inhibited the effects of HGPDS on the expression of VEGF in a dose-dependent manner（P
＜ 0．05）． Conclusion： Flu could decrease VEGF expression in HPMCs which was induced by HGPDS．
［Key words］ fluvastatin；high glucose peritoneal dialysate；human peritoneal mesothelial cells；vascular endothelial growth factor
［Acta Univ Med Nanjing，2013，33（6）：754-758］


腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）已經成為終末期腎臟病（end stagerenal disease，ESRD）的主要替代


［基金項目］ 國家自然科學基金資助（81170660）；江蘇省科技廳基礎研究計劃（自然科學基金）（ BK2011849）；江蘇省衛生廳科研基金資助（H200317）
*通信作者（Corresponding author），E-mail：jiajj3＠sina．com


治療。長期的腹膜透析將導致腹膜功能的衰竭， 腹膜功能的保護是腹膜透析面臨的問題。 腹膜表面的間皮細胞能夠分泌多種物質， 在長期的腹膜透析過程中， 會通過分泌轉化生長因子－β（trans- forming growth factor-β，TGF-β）、血管內皮生長因子
（vascular endothelial growth factor，VEGF） 等增加來

第 33 卷第 6 期
2013 年 6 月


武 俠等：高糖腹透液對腹膜間皮細胞分泌 VEGF 的影響及氟伐他汀的干預作用


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改變腹膜的功能［1－3］。 現在用的腹膜透析液多為非生物相容性的，葡萄糖透析液就為*常用的一種，葡萄糖透析液由于含有多種葡萄糖降解產物（GDP），這些物質會改變腹膜正常結構，使間皮下基質增多，血管增生，通透性增加，*終可能發展為超濾衰竭［4］。有報道 VEGF 在腹膜的通透性增加及血管增生方面發揮重要作用［5］。 本研究旨在探討高糖腹透液（high- glucose peritoneal dialysate，HGPDS） 對人腹膜間皮細胞 （human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）分泌 VEGF 的作用及氟伐他汀對腹膜間皮細胞的保護作用，此類作用尚未見文獻報道。
1材料和方法
1.1材料
人腹膜間皮細胞株（HMrSV5，上海勁馬生物科技有限公司）；氟伐他汀（fluvastatin，Flu，粉劑，北京諾華公司饋贈）；DMEM 培養基（粉劑）、青鏈霉素和胎牛血清（Gibco 公司， 美國）；4．25％ 葡萄糖腹膜透析液（Baxter 公司， 美國）；TRIZOL、RT-PCR 試劑盒
（TaKaRa 公司， 日本）； 兔抗人 VEGF 多克隆抗體
（Abcam 公司，美國）；鼠抗人 GAPDH 單克隆抗體（武漢博士德公司）。
1.2方法
1.2.1細胞培養
HMrSV5 細胞在 37℃、5％CO2 的培養箱內生長， 所用完全培養基為 DMEM 培養基（含葡萄糖濃度為
5．5 mmol ／ L）添加 10％胎牛血清、鏈霉素 100 U ／ L 和

青霉素 100 U ／ L。 2～3 d 換液，待長滿后用 0．25％的胰蛋白酶消化傳代，用于實驗的為第 5～10 代細胞。
1.2.2細胞形態觀察
體外培養 HPMCs，同步化 48 h 后，分組如下：正常對照組、HGPDS 組、 單純 Flu 組、HGPDS＋Flu 組。培養 48 h 后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.3實驗分組
HPMCs 被同步化 48 h 后，分為：①正常對照組
（DMEM 培養基與完全培養基 1∶1 稀釋）； ②HGPDS組 （按 1∶1 的比例稀釋 4．25％腹膜透析液和 DMEM 完全培養基， 分別刺激 0、6、12、24 h）； ③HGPDS＋ Flu （按 1∶1 的比例稀釋 4．25％腹膜透析液和 DMEM 完全培養基， 所加 Flu 濃度為1 × 10－6、1 × 10－7、1 × 10－8 mol ／ L）組；④單純 Flu（按 1∶1 的比例稀釋 DMEM和完全培養基，氟伐他汀濃度為 1 × 10－6 mol ／ L）組，按分組條件均干預細胞 12 h。 干預結束后收集細胞。
1.2.4RT-PCR 檢測 VEGFmRNA 表達
用 TRIzol 法提取細胞總 RNA，分光光度計測定濃度后，從總 RNA 中取 1．0 g 進行逆轉錄獲得 cD- NA，反應體系為 10 μl。 取 1 μl cDNA 模板進行 PCR 擴增，該反應體系為 25 μl。GAPDH 作為內參，其特異性引物由上海英俊生物工程有限公司合成
（表 1），擴增結束后后分別取 PCR產物各 8 μl，2．5％瓊脂糖凝膠電泳（含 0．6 pg ／ ml 溴化乙錠），紫外燈下觀察結果。 圖像分析軟件進行 PCR 條帶灰度掃描， 以 GAPDH 為內參作半定量分析，數值以兩者吸光度比值表示。 同一實驗重復 3次。